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　　本书以基因表达调控原理与基因工程的支撑技术为前提,主要论述了三部分内容:涉及基因高效表达、重组表达产物活性回收、基因工程菌(细胞)稳定生产等基因工程基本原理;包括DNA 的切接反应、重组DNA分子的转化、转化子的筛选与重组子的鉴定五大基因工程单元操作;以大肠杆菌和酵母两个典型的基因工程受体系统为主线,结合具体的产业化案例,归纳出基因工程技术的实际应用战略。本书可作为高等院校生物工程、生物技术、食品工程等专业本科生学习“基因工程”课程的教材,课堂教学建议学时为32学时,也可供从事生物工程技术研究和开发的人员参考。

第1章 概述

  1.1 基因工程的基本概念

  1.2 基因工程的发展历史

  1.3 基因工程的研究意义

第2章 基因表达调控的原理与技术

  2.1 启动子调控模型

    2.1.1 启动子的组成及其功能

    2.1.2 启动子的顺式增强作用

    2.1.3 启动子的反式协同作用

    2.1.4 启动子结构的多样性

  2.2 操纵子调控模型

    2.2.1 操纵子基因表达调控的基本原理

    2.2.2 乳糖操纵子

    2.2.3 半乳糖操纵子

    2.2.4 阿拉伯糖操纵子

    2.2.5 色氨酸操纵子

    2.2.6 入噬菌体的操纵子

  2.3 感受应答调控模型

    2.3.1 感受应答调控模型的基本原理

    2.3.2 真核生物转录调控元件的相互作用

    2.3.3 真核生物转录调控因子的激活方式

  2.4  RNA结构调控模型

    2.4.1 终止子的工作原理

    2.4.2 衰减子的工作原理

    2.4.3 反义子的工作原理

  2.5  RNA剪切编辑调控模型

  2.6 基因工程的支撑技术

    2.6.1 核酸凝胶电泳技术

    2.6.2 核酸分子杂交技术

    2.6.3 细菌转化转染技术

    2.6.4 聚合酶链反应技术

    2.6.5  DNA序列分析技术

    2.6.6 寡核苷酸合成技术

    2.6.7 基因定点突变技术

第3章 基因工程的单元操作

  3.1 工具酶

    3.1.1 限制性核酸内切酶

    3.1.2  T4 DNA连接酶

    3.1.3  DNA聚合酶

    3.1.4 核酸酶

    3.1.5 核酸修饰酶

  3.2 载体

    3.2.1 质粒载体

    3.2.2 λ双链噬菌体DNA载体

    3.2.3 M13单链噬菌体DNA载体

    3.2.4 噬菌体／质粒杂合载体

    3.2.5 人造染色体载体

  3.3 受体细胞

  3.4  DNA的体外重组(切与接)

    3.4.1 DNA切接反应的影响因素

    3.4.2 DNA分子重组的方法

  3.5 重组DNA分子的转化与扩增(转与增)

    3.5.1 转化率及其影响因素

    3.5.2 转化细胞的扩增

  3.6 转化子的筛选与重组子的鉴定(检)

    3.6.1 基于载体遗传标记的筛选与鉴定

    3.6.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定

    3.6.3 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定

  3.7 目的基因的克隆

    3.7.1 鸟枪法

    3.7.2 cDNA法

    3.7.3 PCR扩增法

    3.7.4 化学合成法

    3.7.5 基因文库的构建

第4章 大肠杆菌的基因工程

  4.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理

    4.1.1 启动子

    4.1.2 终止子

    4.1.3  SD序列

    4.1.4 密码子

    4.1.5 质粒拷贝数

  4.2 大肠杆菌工程菌的构建策略

    4.2.1 包涵体型异源蛋白的表达

    4.2.2 分泌型异源蛋白的表达

    4.2.3 融合型异源蛋白的表达

    4.2.4 寡聚型异源蛋白的表达

    4.2.5 整合型异源蛋白的表达

    4.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建

  4.3 重组异源蛋白的体外复性活化

    4.3.1 包涵体的溶解与变性

    4.3.2 异源蛋白的复性与重折叠

  4.4 大肠杆菌工程菌培养的*优化控制

    4.4.1 细菌生长的动力学原理

    4.4.2 发酵过程的*优化控制

    4.4.3 大肠杆菌工程菌的高密度发酵

  4.5 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策

    4.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制

    4.5.2 改善工程菌不稳定性的对策

  4.6 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素

    4.6.1 胰岛素的结构及其生物合成

    4.6.2 人胰岛素的生产方法

    4.6.3 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略

第5章 酵母的基因工程

  5.1 酵母的受体系统

    5.1.1 提高重组异源蛋白产率的突变型受体

    5.1.2 抑制超糖基化作用的突变型受体

    5.1.3 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体

    5.1.4 内源性蛋白酶缺陷型的突变型受体

  5.2 酵母的载体系统

    5.2.1 酿酒酵母中的2¨环状质粒

    5.2.2 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒

    5.2.3 果蝇克鲁维酵母中的环状质粒

    5.2.4 含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建

    5.2.5 含有CEN的YCp载体及其构建

    5.2.6 含有丁EL的YAC载体及其构建

  5.3 酵母的转化系统

    5.3.1 酵母的转化程序

    5.3.2 转化质粒在宿主细胞中的命运

    5.3.3 用于转化子筛选的标记基因

  5.4 酵母的表达系统

    5.4.1 酵母启动子的基本特征与选择

    5.4.2 酵母启动子的可调控表达系统

    5.4.3 外源基因在酵母中表达的限制性因素

    5.4.4 酵母表达系统的选择

  5.5 酵母的蛋白修饰分泌系统

    5.5.1 酵母的蛋白质分泌运输机制

    5.5.2 酵母的信号肽及其剪切系统

    5.5.3 酵母分泌型蛋白的糖基化修饰

  5.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗

    5.6.1 乙肝病毒的结构

    5.6.2 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母构建

    5.6.3 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母构建

  5.7 利用重组酵母生产人血清清蛋白

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前言

　　20世纪70年代,新兴技术基因工程的诞生标志着人类开启了深入认识生命本质并能动改造生命的新时期。作为一项操作生物遗传信息的现代生物技术,基因工程以细胞生物学、分子生物学和分子遗传学的基本理论体系作为指导,在基因的分离克隆、基因表达调控机制的诠释、基因编码产物的产业化、生物遗传性状的改良乃至基因治疗等方面日益显示出极高的实用价值。基因工程正以其迅猛发展和层出不穷的成果驱动着人类社会生活方式发生重大变革。

　　本书从基因表达调控的基本原理和基因工程的支撑技术入手,在介绍基因工程基本条件的前提下,将DNA 重组技术流程分为切、接、转、增、检五大单元操作;在简要阐述目的基因分离克隆战略的基础上,分别以大肠杆菌和酵母两个典型的基因工程受体系统为主线,结合具体的产业化案例,逐一论述基因工程应用的设计思想。

　　编者在已编著的《基因工程概论》和《基因工程》的基础上,结合不断充实的教学讲义和经验体会,另外参考MolecularBiology(FifthEdition,RobertF.著,2011年),MolecularBiologyoftheGene(SeventhEdition,JamesD.Watson等著,2013年)等书籍,对相关内容进行了删减、修订与增补,因而更适合供高等院校生物工程、生物技术、食品工程等专业的本科生学习“基因工程”课程时作为教材,也可供从事生物工程技术研究和开发的人员参考。

　　在本书的编写过程中张玉琛和林岩威帮助收集了部分资料,夏慧和侯兵兵帮助校对书稿,编者在此对他们的辛勤劳动表示衷心的感谢。

　　真诚欢迎专家及其他读者朋友们对本书提出宝贵意见。

　　编者

　　2015年5月